Die 1222 geweihte Abteikirche aus rotem Sandstein, eine dreischiffige Basilika im spätromanischen und frühgotischen Stil mit provenzalischen, elsässischen und burgundischen Anregungen, gilt als eine der bedeutendsten Ordenskirchen Süddeutschlands. Baubeginn war 1157; der Bau wurde jedoch aufgrund finanzieller Engpässe öfters unterbrochen. Die barocke Ausstattung der Abteikirche steht im Kontrast zur Zisterzienserarchitektur, deren Einfachheit jedoch besonders im Ostteil der Kirche sichtbar wird. Die Kirche wurde in Form eines lateinischen Kreuzes in mehreren Bauabschnitten erbaut und weist eine Länge von 70 m, eine Breite von 28,5 m im Querschiff und eine Höhe von 17,5 m auf. Das hohe Mittelschiff hat ein gestelztes Kreuzgratgewölbe ohne Gurte, was den Eindruck einer Spitztonne mit gleich hohen Seitenkappen erweckt. Jedes Seitenschiff hat Viertelkreistonnen mit Stichkappen. Diese Bauformen haben ihre Vorbilder in der Provence und sind in Deutschland einmalig. Die halbrunden Gewölbetragebögen sind stellenweise nur mit Farbe an der Decke aufgemalt. Üblicherweise ist bei solchen Konstruktionen der vermauerte Sandstein zu sehen, der aus der Deckenkonstruktion heraustritt. 1489 und 1498 wurden die Stützen am Nordseitenschiff errichtet.
Das Langschiff der Kirche ist dreischiffig; das Mittelschiff überragt die Seitenschiffe mit seinen hohen Wänden, die nur durch kleine romanische Fenster unterbrochen werden. An der Hauptfassade bieten unterschiedlich gestaltete Portale getrennten Zugang für Laien, Laienbrüder und die Obrigkeit. Im Chorschiff befindet sich der Zugang direkt vom Schlafsaal der Patres bzw. aus dem Kreuzgang. Als Stützen des Mittelschiffs dienen die einmaligen Halbtonnengewölbe der Seitenschiffe sowie abwechselnd Stützpfeiler und Rundsäulen. Bei den beiden letzten Bogen finden sich statt der Rundsäulen wuchtige Säulengruppen. Es ist unklar, ob die Ursache hierfür ein Wechsel in der Bauleitung oder der wasseraderreiche Bauuntergrund war. Das Kirchenschiff selbst weist eine klare Gliederung auf und beinhaltet die Maße des Goldenen Schnitts. Die Fenster des Presbyteriums wurden nachträglich vergrößert. Die vier Ostkapellen im Querschiff waren ursprünglich gestaffelt angeordnet und besaßen halbrunde Apsiden. Sie wurden später auf eine Fluchtlinie gebracht.
Der sogenannte Triumphbogen ist auffallend heruntergezogen und dient als Tragebogen für den Dachreiter. Bis zur Renovierung der Kirche 1956/60 hing unterhalb seiner Schallöffnung der Wappenschild der Klostergründer. Gemäß der Ordensregel wurde nur durch die Verwendung verschiedener Baumaterialien (roter Sandstein, weißer Kalkstein) eine Abwechslung im Flächenbereich geschaffen. Der Mönchschor wurde früher durch einen Lettner vom Laienschiff getrennt, der 1631 von den Wertheimer Klosterstürmern eingerissen wurde. An seiner Stelle trennt nun ein schmiedeeisernes Gitter das Schiff. Das Rokokogestühl im Chor wurde von Daniel Aschauer geschnitzt; die Kanzel der Abteikirche mit den 12 Aposteln, von denen einer gestohlen wurde, stammt von Balthasar Esterbauer aus den Jahren 1704 bis 1706.
Der älteste Raum des Klosters ist die Sakristei. Durch die Verlegung der Brauerei und die dadurch erfolgte Aufschüttung erlitten dieser Raum und die Schnitzereien und Deckengemälde Schäden durch Feuchtigkeit, die trotz zweimaliger Renovierung nicht behoben werden konnten. Die Gemälde zeigen das heilige Messopfer und Ausschnitte aus dem Leben des Abtes Clemens Leuser. Die Schnitzereien eines Erlanger Bildhauers stammen aus den Jahren 1778 und 1779, wodurch wahrscheinlich ist, dass sie in Zusammenarbeit mit Daniel Aschauer entstanden sind.
Vor der Westseite der Kirche stand bis zu ihrer Zerstörung im Dreißigjährigen Krieg und dem Abriss 1631 die sog. Paradieshalle. An der Außenfassade sind noch ihr Dachansatz, die Bogenführung und die Kapitelle zu erkennen. Ohne die Paradieshalle wirkt die Kirche von dieser Seite her sehr wuchtig, da sie hier lediglich durch drei Portale und eine Fensterrosette gegliedert ist. Die große Uhr über dem Hauptportal stammt aus dem Jahre 1800 vom letzten Abt des Klosters, Heinrich V.
Der Dachreiter über dem Portal trägt eine kleine Glocke an der Außenseite, die in Verbindung mit der Kirchenuhr die Zeit anzeigt. Eine kleine Läuteglocke befand sich ebenfalls im Innern; sie wurde jedoch in den Vierungsdachreiter versetzt. Dieser stellt den eigentlichen Glockenturm dar. Er liegt nicht exakt über der Dachvierung, sondern ist leicht nach Westen versetzt. Abt Heinrich ließ 1795 sieben neue Glocken gießen; drei für den großen Dachreiter und vier für den Klostergarten, wo eine Aufhängemöglichkeit geschaffen wurde. Diese Glocken wurden später nach Neustadt und Marktheidenfeld verkauft. Zwei von ihnen wurden wiederum weiterverkauft, entgingen der Einschmelzung zu Kriegszwecken und läuten heute in Euerbach. Sie tragen das Wappen des Abtes Heinrich.
Nach dem Dreißigjährigen Krieg wurde der Innenraum auf Veranlassung der Äbte wieder geschmückt, entgegen der schlichten und einfachen Zisterziensertradition jedoch im Stil des Barocks. Statt der 16 mittelalterlichen wurden nun 13 barocke Altäre aufgestellt, die sich bis heute erhalten haben.
Aus der ehemaligen Andreaskirche, die auch als Leutekirche bekannt war, wurde der Alabasteraltar zu Ehren von Maria Magdalena in die Nordkapelle umgezogen. Gleichzeitig wurde der Bernhardaltar, den die drei ersten Äbte des Ordens (St. Robert, St. Alberich und St. Stephan Harding) und zwei nicht identifizierte Statuen schmücken, in die südlichste Seitenkapelle gestellt. Der jetzige Kreuzaltar aus dem Jahre 1671 von Zacharias Juncker war ursprünglich der Hauptaltar und ersetzte mit seiner Kreuzigungsgruppe von Balthasar Esterbauer unter den Äbten Valentin Mammel und Franz Wundert den notdürftigen Hochaltar, der unter Abt Friedrich aufgestellt worden war. Der Kreuzaltar trug damals das derzeitige Hochaltarbild von Oswald Onghers, das wie bei den meisten Zisterzienserkirchen der Gottesmutter geweiht ist. Er steht heute an der Nordwand des Querschiffes.
Der Hochaltar, der die gesamte Apsis ausfüllt, ist ein Werk des Laienbruders Benedikt Gamuth von 1712. Er wurde von Esterbauer zusätzlich mit vier Statuen versehen, nämlich (von links nach rechts) St. Josef, St. Bernhard, St. Benedikt und dem Ortspatron St. Vitalis. Das Altarblatt zeigt die Himmelfahrt Mariens, es stammt aus dem Jahre 1670 und wurde von Oswald Onghers gefertigt. Abt Engelbert ergänzte den Altar 1750 um den Tabernakelaufbau. Um das eingearbeitete Auge Gottes als Lichtquelle nutzen zu können, wurde beim Altarbau in die Mauer der Apsis ein Fenster gebrochen, welches das Außenzierband der Apsis an der Friedhofsseite zerschnitt. Besonders auffällig sind die beiden Throne im Altarraum. Der kleinere war für den amtierenden Abt und der größere für den Bischof von Würzburg reserviert. Ihre Intarsienarbeiten wurden unter Abt Joseph vollendet; die Pontifikalbestuhlung unter Abt Engelbert.
Esterbauer trug auch die Verantwortung für den Aufbau der vier Altäre vor dem Klausurgitter. Sie wurden 1704 bis 1706 unter Abt Joseph errichtet; ihre Altargemälde stammen wiederum von Onghers, der darin die Vermählung Marias, Bernhardus, die Steinigung des Stephanus sowie Johannes den Täufer darstellte. Bei der Ausführung des letzten Bildes verstarb Onghers. Um die oberen Abschlüsse dieser Altäre mit der Dreifaltigkeit und Mariä Himmelfahrt besser zur Wirkung zu bringen, wurden die mittelalterlichen und die romanischen Sandsteinbögen sowie die wuchtigen Sandsteinsäulen übertüncht. Der alte Farbzustand wurde erst bei der Renovierung in den Jahren 1956 bis 1960 wiederhergestellt. Hierbei fand man unter mehreren Farbschichten die spätgotische Deckenbemalung mit Kräutern, die die Beziehung der Zisterzienser zur Landwirtschaft darstellen.
Der Gnadenaltar aus der Zeit des Abtes Engelmann, der ursprünglich zwischen Presbyterium und der Magdalenenkapelle angebracht war, wurde 1924 an seinen heutigen Standort im letzten Joch der Nordmauer untergebracht. Somit sollte Betern, die keinen Zugang zur Klausur hatten, Gelegenheit zur Andacht gegeben werden. Der Altar stammt aus dem Jahre 1642 und wurde von Michael Kern errichtet.
Der Judas-Thaddäus-Altar in der ersten linken Seitenapsis stammt aus der Amtszeit von Abt Ambrosius und wurde im Jahre 1781 errichtet. Für diesen Altar von Franz Asam wurde zusätzlich ein Rokokofenster in diesen Raum eingebaut.
In der linken Nordost-Apsis befindet sich ein Bernhardsaltar von 1704; dem gleichen Heiligen ist der vierte Altar in der Seitenapsis geweiht. Dieser wurde Mitte des 17. Jahrhunderts von Philipp Preuß errichtet.
Als Abschluss des Mönchschores wurden 1791 unter Abt Heinrich zwei Altäre zu Ehren von Johannes Nepomuk und Karl Barromäus errichtet. Sie wurden von Georg Schäfer aus Karlstadt errichtet. Die Altarblätter stammen aus dem Jahre 1785 von dem Bamberger Maler Hirschmann. Auf den beiden dazugehörenden Kanontafeleinfassungen finden sich Schnitzereien, die eine Ölbergszene und eine Pietà darstellen. Abt Bernhard Widmann ließ 1922 den Altarsockel in die äußerste nördliche Apsis versetzen. Der Holzaufbau mit den typischen Esterbauersäulen, der vorher zum Altaraufbau der Krankenhauskapellenapsis gehörte, wurde hier neu verwendet und mit einem Altarbild von Papst Eugen geschmückt.
Der heutige Prachtaltar wurde unter Abt Joseph errichtet.
Das Chorgestühl wurde in den Jahren 1777/78 nach 20-jähriger Fertigungszeit vom Laienbruder Daniel Aschauer fertig gestellt. Der aus Lengfurt am Main stammende Aschauer, der unter Abt Ambrosius ins Kloster eintrat und die Klosterschreinerei leitete, nahm sich für diese dritte Generation von Gestühl im Chorbereich offensichtlich den Westchor des Mainzer Doms zum Vorbild. Das erste Chorgestühl wurde 1631 bei einem Brand zerstört.
Das Chorgestühl ist in zwei gegenüberliegenden Reihen aufgebaut. Die oberen Plätze waren als Gebetsbereich für die Priestermönche gedacht, während die unteren Plätze für Novizen und Kleriker vorgesehen waren. Laienbrüder mussten in den vorgebauten Brüderplätzen an der Messe und am Chorgesang teilnehmen. Unter jedem Klappsitz brachte Aschauer eine vorstehende Querrippe an. Da die Mönche im Stehen am Chorgebet teilnehmen mussten, bot ihnen dieser sog. Faulenzer oder Misericordia (lat. für Mitleid) die Möglichkeit, im stehenden Sitz zu beten. Alle Stallen, wie man die Einzelbetplätze der Mönche nannte, sind mit geschnitzten Symbolen versehen, die teilweise vergoldet sind.